מוצרים

כדי לכמת באופן ספציפי מספר מטבוליטים של 5-fluorouracil (5-FU) ושני נוקלאוטידים מונו-פוספטים אנדוגניים, פיתחנו שיטה מקורית המבוססת על כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדמית (LC-MS/MS).בדיקה זו אפשרה את הקביעה של: (i) הייצור התוך תאי של 5-fluoro-2'-deoxyuridine-5'-monophosphate (5-FdUMP) מ-5-FU או 5-fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdUrd) , (ii) ההשפעה של ריכוז 5-FdUMP על היחס התוך תאי 2'-deoxyuridine-5'-monophosphate (dUMP)/thymidine-5'-monophosphate (TMP), ו-(iii) מידת ההפרשה של 5-FdUMP ו 5-FU מתאי תרבות אנושיים על ידי טרנספורטרים של ABC.בתנאי הניסוי שלנו, תאים הודגרו עם 5-FU או 5-FUrd.לאחר מכן, חלבונים תאיים היו משקעים על ידי מתנול.הליך זה סיפק התאוששות חילוץ גבוהה.בנוסף, כדי למדוד הפרשת 5-FU ו-5-FdUMP מתאי, ביצענו כימות של מולקולות אלו במצע תרבות.המדיה הוזרקה ישירות (5-FU) או תחת מיצוי שלב מוצק באמצעות מחסנית מיצוי Oasis Wax (5-FdUMP).הפרדת האנליטים בוצעה על עמודה dC18 Atlantis 3.5 מיקרומטר, (100 מ"מ × 2.1 מ"מ id) במצב איזוקרטי באמצעות חיץ אמוניום פורמט/מתנול/מים (5/5/90, v/v) כפאזה ניידת.זמן הריצה לא עלה על 6.2 דקות.האנליטים היו מיוננים בממשק אלקטרוספריי במצב יון שלילי.אימתנו את השיטה בטווח של 2.5-150 ng mL -1 בהתאם לתרכובות.השונות תוך-ובין-מבחנים הייתה נמוכה מ-10% במשך שבעה ימים.כל התרכובות היו יציבות בתאים או במצע תרבות כאשר הדגימות אוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לפחות, ולאחר שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה.לא נצפתה אפקט מטריצה ​​בשני המדיות.