מוצרים

הבנת חילוף החומרים של המארח המיקרוביאלי חיונית לפיתוח ואופטימיזציה של תהליכים ביו-קטליטיים מבוססי תאים שלמים, שכן היא מכתיבה את יעילות הייצור.זה נכון במיוחד עבור biocatalysis חיזור שבו תאים פעילים מטבולית מועסקים בגלל יכולת התחדשות קו-פקטור/קו-סובסטרט האנדוגנית במארח.Escherichia coli רקומביננטי שימש לייצור יתר של proline-4-hydroxylase (P4H), דיאוקסיגנאז המזרז את ההידרוקסילציה של L-proline חופשי לטרנס-4-hydroxy-L-proline עם a-ketoglutarate (a-KG) כקו-סובסטרט.בביו-קטליזטור של תא שלם זה, מטבוליזם מרכזי של פחמן מספק את ה-co-substrate הדרוש a-KG, ומצמיד ביצועים ביו-קטליטיים של P4H ישירות לחילוף החומרים של פחמן ולפעילות מטבולית.על ידי יישום כלים ניסיוניים וחישוביים כאחד, כגון הנדסה מטבולית וניתוח שטף (13)C-מטבולי ((13)C-MFA), חקרנו ותיארנו באופן כמותי את התגובה הפיזיולוגית, המטבולית והביו-אנרגטית של הביו-קטליזטור של כל התא. להמרה הביולוגית הממוקדת וזיהה צווארי בקבוק מטבוליים אפשריים להנדסת מסלולים רציונליים נוספים. זן E. coli חסר פירוק פרולין נבנה על ידי מחיקת הגן putA המקודד לפרולין דהידרוגנאז.טרנספורמציות ביולוגיות של תאים שלמים עם זן מוטנטי זה הובילו לא רק להידרוקסילציה כמותית של פרולין אלא גם להכפלה של קצב יצירת הטרנס-4-L-hydroxyproline (hyp) הספציפי, בהשוואה לסוג הבר.ניתוח של שטף פחמן דרך מטבוליזם מרכזי של הזן המוטנטי גילה שהביקוש המוגבר של a-KG לפעילות P4H לא הגביר את השטף היוצר a-KG, מה שמצביע על פעולת מחזור TCA מווסתת היטב בתנאים שנחקרו.בזן הבר, סינתזה וקטליזה של P4H גרמו להפחתה בתפוקת הביומסה.מעניין לציין שזן ΔputA פיצה בנוסף על אובדן ה-ATP וה-NADH הקשורים בכך על ידי הפחתת דרישות אנרגיית תחזוקה בשיעורי ספיגת גלוקוז נמוכים יחסית, במקום להגביר את פעילות ה-TCA. ה-putA נוקאאוט ב-E. coli BL21(DE3)(pLysS) רקומביננטי נמצא להיות מבטיח לזרזת P4H פרודוקטיבית לא רק במונחים של תפוקת ביו-טרנספורמציה, אלא גם לגבי שיעורי הביו-טרנספורמציה וספיגת פרולין ותפוקת ההיפ על מקור האנרגיה.התוצאות מצביעות על כך שעם נוק-אאוט של putA, הצימוד של מחזור ה-TCA להידרוקסילציה של פרולין דרך הקו-סובסטרט a-KG הופך לגורם מפתח מגביל ומטרה לשיפור היעילות של טרנספורמציות ביולוגיות תלויות a-KG.